西湖大学蔡尚团队成功构建离体乳腺微器官模拟复杂生理及肿瘤发生

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类器官（Organoid）是一种体外自组织的用以模拟器官结构和功能的3D细胞组织形态，通常来源于诱导多能干细胞、胚胎干细胞或成体组织干细胞。与平面培养的细胞相比，类器官能够更好地模拟器官的空间结构、组织关系、基因表达、代谢动态以及关键功能，为我们理解器官的形态构建、发育过程、稳态维持以及功能实现提供了重要的细胞生物学模型，同时在推动临床医学的药物靶点筛选、精准治疗等方面具有巨大的应用价值。

2009年，荷兰科学家Hans Clevers成功地利用了LGR5+的小肠干细胞培养出了具有隐窝结构的小肠类器官，开启了类器官研究的热潮，继而多种正常组织及实体肿瘤组织的类器官被成功培养。这些类器官在模拟组织结构，治疗响应等方面均展现了与在体组织一定的相似性。然而，目前的类器官培养体系在结构与功能的完整性（integrity），系统的稳定性（robustness）与复杂性（complexity）等方面与在体器官仍存在较大差距，具有很大的完善空间。

与其他组织相比，乳腺组织具有复杂的分枝状管腔结构及周期性生理特征，体外模拟具有一定的难度。尽管目前已经开发了多种乳腺类器官的培养系统，但是在实现细胞的成熟度、细胞的异质性以及长时间的培养上仍存在一定的局限性，因此，很难应用于研究诸如组织稳态和疾病转化过程中的细胞行为等复杂的生理过程。如何将建立了简单细胞通讯的乳腺类器官（organoid）发展成为具有稳定结构及功能的乳腺微器官（mini organ）是推动疾病模型研究的关键。

北京时间2023年11月2日，西湖大学蔡尚团队在Nature Methods发表题为“Reconstruction of Dynamic Mammary Mini Gland in vitro for Normal Physiology and Oncogenesis”的文章，成功构建了小鼠乳腺微器官（mini gland）的体外动态培养体系，能够将乳腺干细胞逐步诱导形成具有次级分支结构的树状管腔，在细胞组成及转录异质性上维持了与正常乳腺相似的特征，并且能够模拟乳腺在青春期、生理期及怀孕哺乳期的生理变化，再现胚胎期到出生后乳腺多能干细胞到单能干细胞的命运转变，同时也能够模拟乳腺上皮细胞获得原癌基因后的成瘤过程。与以往的乳腺类器官培养体系相比，此研究展现的乳腺微器官具有更完善的生理结构，更高的稳定性，更长的培养时间以及展现更复杂的生理、病理过程的潜能，为乳腺干细胞的功能性研究、谱系分化研究、微环境互作研究，以及肿瘤发生的早期病理过程研究提供了有力的工具。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-02039-y

乳腺微器官培养体系的建立

为了建立更加稳定完善的乳腺类器官系统，蔡尚团队参考了乳腺器官在小鼠胚胎发育中的形成过程（原基形成anlage formation，极性建立polarity establishment，对称性打破symmetry breaking，分支延伸branching），通过分离成体乳腺干细胞诱导形成干细胞球，然后结合胞外基质的优化诱导Basal-Luminal极性建立，进一步通过调节FGF介导的细胞运动诱导克隆的对称性打破，再结合引入生理周期中的激素变化以及环境中的信号分子诱导分支延伸的产生，他们构建了一个成体干细胞来源的具有分支结构的乳腺微型器官培养系统（图1）。

图1. 乳腺微器官的构建方法

乳腺微器官维持了乳腺组织的细胞和分子异质性

团队成员进一步验证了乳腺微器官是否能够维持体内乳腺的形态结构、细胞组成以及分子特征。研究人员发现，培养的乳腺类器官分支末端能够产生和体内青春期乳腺相似的Terminal End Bud（TEB）结构，并且随着长时间的培养，这些TEB的结构也能够形成类似成年期分支末端的Tip结构（图2）。通过免疫荧光染色分析可以发现乳腺类器官能够维持相应标志物的表达以及正确的定位，流式分析进一步证明乳腺类器官能够很好的分化产生luminal和basal细胞类群（图2）。为了进一步验证分子层面的相似性，研究人员又进行了单细胞测序分析，实验结果可以看出乳腺微器官能够很好地分化产生Elf5+luminal、ER+luminal以及basal亚群，并且聚类分析的结果也显示乳腺微器官相应的细胞类群能够较好地与体内乳腺组织相应的细胞类群聚类（图2）。通过这些实验结果，研究人员证实了离体乳腺微器官与体内乳腺在结构、组成及细胞状态方面的相似性。

图2. 乳腺微器官维持了体内的形态结构、

细胞组成以及分子特性

乳腺微器官能够模拟乳腺在生理期及生殖期的动态变化

乳腺是一个动态的器官，严格的受到激素的调控，在一生当中会不断地经历发情周期带来的结构变化，并且在怀孕哺乳时期乳腺上皮结构能够特化产生具有分泌乳汁功能的腺泡细胞。那么体外产生的乳腺微器官是否也维持了体内乳腺这些相应的功能呢？

研究人员通过调控激素浓度的变化来模拟小鼠体内的发情周期，研究结果发现，在发情周期的过程中，类器官能够很好的对激素环境做出响应，进而促进了导管的延伸以及侧枝的产生（图3）。

接下来，研究人员通过短暂的模拟怀孕时期的激素变化，进一步刺激诱导了哺乳时期腺泡结构的产生，同时，研究发现这些腺泡结构也能够产生分泌乳汁（图3）。为了进一步探究哺乳时期的乳腺类器官能否像体内的结构一样经历退化期，研究人员进行了尝试，研究结果发现，通过短暂的模拟哺乳后退化的过程，能够使得腺泡结构退化消失最终恢复成正常的乳腺导管结构（图3）。

图3. 乳腺微器官再现了乳腺在生殖周期中的变化

乳腺微器官能够模拟多能干细胞的命运转变

许多组织都是由异质性的干细胞组成，包括长期干细胞和短期干细胞或静止期干细胞和活跃态干细胞，而细胞命运的转变总是伴随着发育过程、组织适应、应激反应以及病理状态下的转化。在乳腺中，Krt14+干细胞在胚胎阶段是双能的，但在出生后主要变成单能的类群。由于体内的复杂性以及跨越胚胎期到出生后的过程，因此，目前仍然难以探究细胞命运的转变是如何发生的。

为了解决这一问题，研究人员利用乳腺微器官模型评估了体外追踪干细胞命运的潜力，通过使用Krt14rtTA/TetO-Cre/Rosa-mTmG来源的细胞进行体外谱系示踪实验。在谱系示踪分析中，他们发现早期的这些乳腺类器官维持了乳腺干细胞的多能性，能够同时分化产生luminal和basal细胞类群，而后期标记的细胞主要产生basal细胞类群（图4），转化为单能干细胞。这个研究结果很好地再现了从胚胎期多能性到出生后单能性的命运转变，更重要的是，离体的系统能够清晰的捕捉到细胞命运转变的窗口期，这一发现能够为未来探究细胞命运转变的机制提供重要的研究手段。

图4. 乳腺微器官再现了干细胞的命运转变

乳腺微器官能够模拟乳腺癌的发生过程

与传统的2D细胞系培养相比，稳定的3D类器官培养系统使我们能够从早期阶段追踪疾病发展的整个过程。为了探究乳腺类器官应用于疾病模型的可能性，研究人员构建了mCherry-LSL-PyMT-GFP表达载体，并将其转导至Rosa-26 CreERT2的细胞中，通过tamoxifen诱导PyMT表达来探索乳腺类器官模拟肿瘤起始的能力。研究发现诱导了部分表达PyMT的细胞在长时间的培养过程中能够观察到部分结构异常的增殖，并最终形成了肿瘤样的结构（图5）。这些肿瘤样结构移植到小鼠体内均形成了肿瘤。

图5. 乳腺微器官能够模拟肿瘤的起始

总的来说，该研究开发的培养方法，成功建立了在结构功能、细胞组成、分子特征、干细胞动态以及肿瘤发生等方面与小鼠乳腺组织高度相似的乳腺微器官，为器官生理功能及疾病发生的细胞生物学研究搭建了新的平台。

西湖大学蔡尚研究员为论文通讯作者，西湖大学生命科学学院2018级博士研究生袁雷为本文第一作者，博士研究生谢少芳、白惠茹、刘肖琴参与了部分研究工作。本项目获得了国家自然基金委、西湖实验室以及西湖教育基金会的资助；项目实施过程中得到了西湖大学实验动物中心、流式平台以及成像平台的大力支持。

蔡尚博士的研究主要以乳腺为模式器官，探讨乳腺干细胞在青春期、孕期、哺乳期对乳腺特定结构功能的维持，以及乳腺癌干细胞在癌症的发生、发展、抗药性、复发及转移过程中的重要作用。蔡尚团队围绕干细胞的再生、谱系分化以及疾病状态下的功能异常从细胞生物学、发育生物学、遗传学、组学及癌症生物学等多方面展开全方位研究。集中进行（但不限定于）以下几个方面：乳腺细胞的谱系关系及不同发育时期的动态变化；衰老、增生及其他疾病状态下干细胞的功能异常；癌症干细胞抗药性的产生及复发转移的机理机制。

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