首先，该研究在Vero E6细胞系中通过不断增加WU-04的浓度，获得了可以在高浓度WU-04条件下复制的SARS-CoV-2变异株，并测序确定其3CLpro携带M49K/M165V或M39K/S301P突变。通过体外表达3CLpro突变蛋白和活性测试，发现单突变M49K、M165V和S301P均可导致WU-04抑制活性降低，并影响WU-04与3CLpro结合。双突变M49K/M165V和M49K/S301P使WU-04抑制活性进一步降低。此外，研究发现耐药突变同时降低了3CLpro酶活性，表明3CLpro在获得耐药能力的同时，需要牺牲自身酶活性（图2）。

其次，该研究通过解析3CLpro耐药突变体晶体结构，揭示了不同耐药突变具有不同的耐药机制。结构分析表明，M49K突变导致其所在的短螺旋（45-51位氨基酸）变得不稳定，从而影响了3CLpro底物结合口袋的构象，解释了M49K引起的3CLpro与WU-04结合能力的下降，以及3CLpro催化活性的降低。底物结合可稳定M49K突变体该短螺旋的构象，但WU-04结合则不具有稳定该短螺旋的作用，表明M49K突变对抑制剂WU-04结合的影响大于对底物结合的影响，解释了耐药突变仅有限牺牲自身酶活性，就让3CLpro获得耐药能力。M165V突变则通过位阻效应直接干扰WU-04的结合（图3）。

S301P突变采取了一种新的耐药策略。晶体结构显示该突变限制了3CLpro羧基端301-306位氨基酸所在肽段的自由旋转，使3CLpro二聚化能力下降，从而导致对WU-04的耐药（图4）。

该文章还研究了WU-04和已上市的3CLpro抑制剂奈玛特韦（nirmatrelvir）、恩赛特韦（ensitrelvir，在日本上市）的耐药突变对3CLpro热稳定性和酶活性的影响，以及对WU-04、奈玛特韦和恩赛特韦的交叉耐药风险。结果表明，大部分突变均可导致3CLpro酶活性和热稳定性的降低。这些突变对不同抑制剂的耐药程度存在差异，同一位点不同突变对不同抑制剂有迥然不同的影响，凸显了开发具有不同骨架的多种抑制剂用于抗冠病毒治疗的重要性。

综上，该文章解释了3CLpro突变导致WU-04耐药的分子机制，并探索了不同骨架结构的3CLpro抑制剂的耐药突变对3CLpro自身活性的影响，以及潜在交叉耐药风险，为我们理解病毒如何逃逸3CLpro抑制剂的抑制、开发新的广谱抗病毒药物提供了重要信息。

西湖大学胡奇研究员和美国德克萨斯大学医学分部史佩勇教授为本文的共同通讯作者，西湖大学-浙江大学联培项目2019级博士研究生张莉婧、美国德克萨斯大学医学分部谢旭平助理教授为本文的共同第一作者。西湖大学博士生罗翰楠、钱润彤以及中国科技大学杨洋博士对本文的研究工作做出了重要贡献。西湖大学黄晶研究员和于洪涛教授为本研究提供了指导和支持。感谢西湖大学晶体学平台、质谱与代谢平台对该研究的支持和帮助。