西湖大学雷凯团队利用渐冻症患者诱导多能干细胞建立了新的神经肌肉类器官疾病模型

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北京时间2024年3月1日，西湖大学雷凯团队在Cell Reports在线发表了题为“Neuromuscular organoids model spinal neuromuscular pathologies in C9orf72 amyotrophic lateral sclerosis”的研究成果。

该研究报道了一种利用患者诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）构建神经肌肉类器官（Neuromuscular Organoids, NMOs）的方法，用于研究渐冻症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）的体外疾病模型。研究团队使用C9orf72突变的ALS患者的iPSCs，成功地诱导出NMOs。这些NMOs模拟了包括骨骼肌收缩障碍，神经肌肉接头退化和蛋白异常堆积等疾病相关的病理特征。同时，研究团队还展示了这种类器官模型对测试ALS治疗药物的功效。

该研究为进一步探索ALS的发病机制和治疗靶点提供了新的研究工具，为未来高通量筛选及个体化医疗提供了研究模型。实验室正在加速推进渐冻症转化医学研究，亟需具备细胞生物学、分子生物学、生物信息学、和高通量药物筛选经验的博士后、研究助理、博士研究生加盟，诚邀各方才俊、有志之士加入，携手共同成长。

文章链接：

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(24)00220-1

文章截图：

渐冻症即肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），是一种多因素共同作用的神经退行性疾病，其主要特征是运动神经元的退行性改变。一般情况下，ALS患者的生存年限不超过两年，仅有10%的患者存活超过5年。目前已确定与ALS发病直接相关的基因有30多种，而家族性患者仅占总病例数的约10%。这些因素限制了小鼠等动物模型的开发，从而限制了ALS的机制研究与药物研发。因此，开发新的能模拟疾病表型且满足高通量筛选的体外疾病模型，对于ALS及其他神经退行性疾病的治疗手段的开发将起到巨大作用。

研究人员利用C9orf72（C9-ALS）患者iPSCs作为模型（C9n1，C9n6，C9n3），经CRISPR/Cas9介导的突变修正iPSCs作为对照（C9n1ISO，C9n6ISO），通过定向诱导手段，构建了神经肌肉类器官（NMOs），用于研究ALS。研究人员发现，NMOs具有与渐冻症神经肌肉退行性病理改变相对应的细胞与组织结构，包括运动神经元、中间神经元、神经胶质细胞、骨骼肌和神经肌肉接头等。

图1. C9orf72-iPSCs构建形成神经肌肉类器官

基于ALS临床症状，研究人员发现使用C9-iPSCs培养至第100天的NMOs，在骨骼肌侧观察到明显的神经肌肉接头（Neuromuscular Junction, NMJ）退化现象（图2）。研究结果还显示，在这个时间点，来自ALS患者的NMOs在骨骼肌收缩频率方面，无论在基础状态还是加入谷氨酸刺激后，均显著低于对照组。这些结果表明，患者来源的NMOs能够模拟ALS中与骨骼肌失神经和功能失调等病理特征相关的现象。

图2. C9orf72-NMOs对ALS相关的骨骼肌失神经的模拟

C9orf72基因突变是其外显子1中插入了高度重复 (GGGGCC)n序列，该重复序列的异常转录及翻译导致细胞核中形成RNA foci，细胞质中形成二肽重复序列蛋白（DPRs）异常聚集。研究人员发现C9-NMOs神经元和胶质细胞中存在RNA foci在细胞核的聚集，以及C9orf72相关的DPRs蛋白PolyGA在细胞质的异常聚集（图3）。这些发现证实，患者来源的NMOs能够模拟C9orf72突变型ALS患者神经组织中的特定病理指征。

图3. C9orf72-NMOs对其特异性病理指征的模拟效应

为了进一步研究NMOs对ALS神经退行性病理学特征的模拟效应，研究人员测试了神经元和胶质细胞中与自噬相关的蛋白P62的分布情况（图4A-C）。研究发现，来自C9-iPSCs的NMOs中，神经元和胶质细胞中出现了明显的P62蛋白堆积，提示该模型表现出与ALS相关的神经组织退行性改变。此外，为了进一步研究ALS来源的NMOs中神经功能的改变，研究人员通过钙成像手段测试了神经元的电生理变化（图4D-I）。钙成像实验结果显示，C9-iPSCs来源的NMOs出现了明显的钙信号下降。综上所述，这些结果表明NMOs能够有效模拟与ALS相关的神经退行性改变。

图4. C9orf72-NMOs对ALS相关的神经退行性改变的模拟效应

随后，为了进一步探索NMOs是否能够作为药物研究及筛选的工具，研究人员使用PERK抑制剂GSK2606414对C9-NMOs进行处理。通过评估发现，GSK2606414能够有效降低C9-NMOs中DPRs的堆积及自噬现象，并显著改善了骨骼肌侧的收缩功能，并发现该效应还受到给药时间和剂量的影响。

综上所述，研究团队建立了一种能够模拟ALS患者躯干脊髓神经系统及外周骨骼肌病变的类器官模型。研究人员相信该模型能够用于未来ALS或者其他神经肌肉接头类疾病的药物测试及相关分子机制的研究。

西湖大学生命科学学院的研究员雷凯为本文的通讯作者；原西湖大学博士后、现浙大城市学院副教授高充为本文的第一作者。其他合作者还包括西湖大学的石清华、潘雪、陈佳佳、文杉、张玉红、郎佳丽，西湖大学研究员刘晓东，复旦大学脑科学转化研究院研究员程田林；课题得到了浙江省“尖兵领雁+X”研发攻关计划、西湖实验室（生命科学和生物医学浙江省实验室）、国家自然科学基金，西湖大学教育基金会、上海市自然科学基金和科技计划项目的资助；项目实施还得到了西湖大学生物医学实验技术中心、西湖大学裴端卿实验室、常兴实验室、马丽佳实验室、南京医科大学刘妍实验室、德国柏林Max Delbrueck 分子医学中心Mina Gouti团队的支持与帮助。

西湖大学雷凯团队（https://en.westlake.edu.cn/faculty/kai-lei.html）致力于神经再生与干细胞生物学的研究，通过类器官、涡虫及小鼠模型，探索组织再生、神经退行性疾病及修复的分子机制与治疗靶点。本研究为进一步探索ALS的疾病机制、治疗靶点提供了新的研究工具，为未来高通量筛选及个体化医疗提供了研究模型。实验室正在加速推进渐冻症转化医学研究，亟需具备细胞生物学、分子生物学、生物信息学、和高通量药物筛选经验的博士后、研究助理、博士研究生加盟，诚邀各方才俊、有志之士加入，携手共同成长。（联系方式：lei_lab@westlake.edu.cn）