2024年1月4日，西湖大学解明岐团队、浙江大学邵佳伟团队和之江实验室王慧团队在Cell Research 杂志上联合发表了题为Engineered poly(A)-surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells 的最新研究成果，报导了一套新型基因表达控制系统，全面实现各种基因疗法的智能化精准调控。通过对人体细胞中蛋白质翻译起始的“mRNA首尾环化过程”进行工程化改造，该系统不仅能够接收不同的外源信号来远程、高效调控多种治疗蛋白药物的表达和生产，从而实现安全、可控的药物递送，还突破了胞质内肿瘤标记物的识别瓶颈，在探测到肿瘤组织中特异性标记物后，可自主识别并彻底清除癌细胞。该调控策略对未来基因治疗在临床中的安全性、可控型和精准化应用具有重要意义。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41422-023-00896-y

精准控制基因表达对于实现高效、安全的基因和细胞治疗至关重要。目前，合成生物学基因开关大多基于转录调控系统，不仅信号感知和决策速率慢，而且在应对位于细胞质内的疾病标记物时，表现的束手无策。虽然一直以来翻译调控系统有潜力解决这些弊端，但目前已报导的系统因调控效率低，仅在细胞层次上表现出一定的潜力，很难真正应用到体内的疾病治疗。本工作巧妙地打造了新型的基因环路，将mRNA自身的多聚腺苷酸尾(poly-A)区域替换成人工合成的“特异性结合域”，利用“首尾环化”机制实现目标基因的精准、高效和特异性调控，最终突破了现有翻译系统效率低的瓶颈，成功将转录后调控策略引入基因疗法的赛道。

经典真核生物翻译起始过程由多种翻译起始因子（initiation factor）eIFs和多聚腺苷酸结合蛋白(PABP) 协同完成。其中eIF4E在翻译起始前，结合到成熟mRNA的5’帽端（5’UTR），并招募中心支架蛋白eIF4G，而PABP蛋白则通过同时结合eIF4G和mRNA 3’ 非翻译区（3’UTR）的 poly-A，使mRNA的5’UTR和3’UTR 相结合来形成环状的“首尾相连”结构，最终招募43S前翻译起始复合物而促进蛋白质的生物合成(1,2)。由此可见mRNA的首尾环化在翻译起始过程中发挥重要作用。利用此环化机理，研究人员开发了“可控环化“的翻译调控系统。该系统的基础框架为定制化mRNA和人工翻译起始因子(synthetic translation initiation factor, STIF)。打造定制化mRNA的关键步骤是将原mRNA的poly-A切除，同时在3’UTR区域引入特异性结合STIF因子的核酸适配体序列，从而形成“人工定制化尾巴（poly-A surrogate）”。STIF由RNA结合蛋白MCP/L7Ae和可结合5’UTR的轮状病毒来源的NSP3蛋白相融合，一端结合到”尾部“的核酸适配体区，另一端直接招募eIF4G及相关的翻译起始复合物，最终促进定制化mRNA“成环”来起始目标基因的翻译（图1）。该设计彻底解决了长期存在的翻译表达调控效率低的难题，有效提高基因调控系统在体外和体内工作效率，使其有望应用于未来可控型基因治疗的临床应用中。

图1

在此翻译控制系统的基础上，研究人员进一步构建了拆分型翻译起始因子，将不同的二聚或三聚蛋白对分别与RNA结合蛋白和NSP3融合，赋予了翻译调控系统响应光照（红光、蓝光），小分子(Grazoprevir，Danoprevir，脱落酸，赤霉酸，雷帕霉素)，或者细胞内特定蛋白质靶标和信号的能力（图2）。

图2

其中响应Grazoprevir的翻译调控基因开关在调控基因治疗方面表现突出。该基因开关可以适配现有各种基因治疗载体，包括DNA、体外转录RNA以及AAV表达系统。以糖尿病的基因治疗为例，通过搭载该基因开关，口服Grazoprevir便可以调控上述不同治疗载体在体内进行糖尿病治疗，实现疾病治疗的智能化。而Grazoprevir 作为FDA批准的小分子药物将进一步有助此基因开关在临床上的应用开发（图3）。

图3

翻译调控系统的重要优势在于能够识别转录系统无法企及的细胞质内的生物元件(图4)。研究人员进一步挖掘此优势，通过将NSP3和RNA结合蛋白分别与蛋白标记物的特异性纳米抗体相连，得到了功能强大的蛋白质传感器。该感受器具有独特的空间感知优势，可以感知定位于不同细胞质的蛋白靶标。而基于转录起始的蛋白感受器只能感应存在于细胞核中的信号（图4）。

图4

该蛋白质传感器成功弥补了现有基因线路无法感知只存在于细胞质里的肿瘤异常蛋白的技术空白（如一系列癌症特异性的融合蛋白）。将相关基因环路原位导入小鼠皮下荷瘤模型中后，其能自主探测到肿瘤胞质内的特异性标记物，通过形成关键性的“首尾相连”结构，启动凋亡基因Bax的表达，来最终实现异常组织的自我清除（图5）。

图5

研究人员进一步将该系统与其它类型的基因传感器相结合，通过多输入的“生物计算”系统来精准化识别更加复杂病理环境。最终可为多种复杂疾病定制出诊断、治疗、预防一体化的智能化基因疗法（图6）。

图6

总而言之，该研究通过工程化改造“翻译成环”过程，开发了新的基因调控机制，丰富了合成生物学方面的细胞工程策略（工具箱）。在应用方面，该策略极大的提升了翻译调控系统应用于基因治疗的潜力，克服了当前基因治疗策略不可控的安全隐患，同时也可将治疗目标扩展到需要实时监控和动态干预的疾病中，而不仅仅是局限于需要长期无间断干预的疾病治疗。另外本研究成果蛋白传感器，首次成功赋予基因治疗手段响应蛋白信号的功能。该功能将推动癌症、微生物感染等多种复杂疾病的精准、智能化疗法的临床开发。

该论文由西湖大学、浙江大学和之江实验室合作完成，其中西湖大学解明岐研究员，浙江大学邵佳伟研究员和之江实验室王慧研究专家为该论文的共同通讯作者；浙江大学邵佳伟研究员，西湖大学/浙江大学联合培养的博士研究生李世超，国防科技大学朱凌云教授课题组的助理研究员邱鑫源和西湖大学博士研究生蒋健为该论文的共同第一作者。

本课题受到科技部重点研发项目、国家自然科学基金、西湖实验室（生命科学和生物医学浙江省实验室）、浙江省生长调控和转化研究重点实验室及西湖教育基金会的资助和支持。